Тан, округ Колумбия, ДеВит М, Джонстон С.А. Генетическая иммунизация – простой метод вызвать иммунный ответ. Природа. 1992;356(6365):152–4. https://doi.org/10.1038/356152a0
Улмер Дж.Б., Доннелли Дж.Дж., Паркер С.Е., Роудс Г.Х., Фельгнер П.Л., Дварки В.Дж. и др. Гетерологичная защита от гриппа путем инъекции ДНК, кодирующей вирусный белок. Наука. 1993;259(5102):1745–9. https://doi.org/10.1126/science.8456302
Доннелли Дж.Дж., Улмер Дж.Б., Шивер Дж.В., Лю М.А. D NA-вакцины. Анну Рев Иммунол. 1997;15:617–48. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.15.1.617
Гурунатан С., Клинман Д.М., Седер Р.А. D NA-вакцины: иммунология, применение и оптимизация. Анну Рев Иммунол. 2000;18:927–74. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.18.1.927
Вакцины Hobernik D, Bros M. D NA — насколько далеки от клинического применения? Int J Mol Sci. 2018;19
:3605. https://doi.org/10.3390/ijms19113605
Лю М.А., Ульмер Дж.Б. Клинические испытания вакцин на основе плазмидной ДНК на людях. Адв Генет. 2005;55:25–40. https://doi.org/10.1016/S0065-2660(05)55002-8
Венигер Б.Г., Энглин И.Е., Тонг Т., Пенсиеро М., Пуллен Дж.К., Семинар по устройствам доставки нуклеиновой кислоты для вакцин против ВИЧ. Отчет о семинаре: Устройства для доставки нуклеиновых кислот для вакцин против ВИЧ: материалы семинара, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Бетесда, Мэриленд, США, 21 мая 2015 г. Вакцина. 2018;36
:427–37. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2017.10.071
Парди Н., Хоган М.Дж., Портер Ф.В., Вайсман Д. м-РНК-вакцины — новая эра в вакцинологии. Nat Rev Drug Discov. 2018;17
:261–79. https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243
Кумарагурубаран К, Калиаперумал К. Д. Вакцина NA: миниатюрное чудо. Ветеринар. Мир. 2013;6
:228–32. https://doi.org/10.5455/vetworld.2013.228-232
Краненбург Р. Разработка идеальной ДНК-вакцины требует оптимизации стратегий доставки и плазмидных векторов. БиоФарм Интернешнл. 2011;Приложение 2011
. http://www.biopharminternational.com/dna-vaccine-delivery
Гармори Х.С., Браун К.А., Титболл Р.В. Вакцины D NA: улучшение экспрессии антигенов. Генет Вакцины Тер. 2003;1:2. https://doi.org/10.1186/1479-0556-1-2
Ли Л., Петровский Н. Молекулярные механизмы повышения иммуногенности ДНК-вакцин. Эксперт Рев Вакцины. 2016;15
:313–29. https://doi.org/10.1586/14760584.2016.1124762
Лю З, Чен О, Уолл JBJ, Чжэн М, Чжоу Ю, Ван Л и др. Систематическое сравнение пептидов 2А для клонирования мультигенов в полицистронном векторе. Sci Rep. 2017;7
:2193. https://doi.org/10.1038/s41598-017-02460-2
Ли Л, Петровский Н. Молекулярные адъюванты для ДНК-вакцин. Curr Issues Мол Биол. 2017;22:17–40. https://doi.org/10.21775/cimb.022.017
Дарке А.М., Кэмерон Б., Уилс П., Шерман Д., Крузе Дж. Новый ДНК-носитель для доставки невирусных генов: сверхспиральный миникруг. Джин Тер. 1997;4:1341–9. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300540
Харди К.Л., Аревало-Солис Л.М., Хорнштейн Б.Д., Зехидрих Л. Достижения в области невирусных векторов ДНК для генной терапии. Гены (Базель). 2017;8
:65. https://doi.org/10.3390/genes8020065
Стенлер С., Бломберг П., Смит CE. Безопасность и эффективность ДНК-вакцин: плазмиды против миникольцев. Хум Вакцина Иммунотер. 2014;10
:1306–8. https://doi.org/10.4161/hv.28077
Пушко П, Ишмухаметов АА, Вреденбек П.П., Лукашевич И.С. Экспериментальные живые аттенуированные вакцины против желтой лихорадки на основе инфекционных ДНК. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2019;18
:18–25. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2019-18-1-18-25
Пушко П., Лукашевич И.С., Уивер С.С., Третьякова И.Д. Запущенные в NA живые аттенуированные вакцины для биозащиты. Эксперт Рев Вакцины. 2016;15
:1223–34. https://doi.org/10.1080/14760584.2016.1175943
Даллмайер К., Нейтс Дж. Бактериальные искусственные хромосомы. Патент WIPO N WO2014174078; 2014.
Улмер Дж.Б., Мейсон П.В., Гилл А., Мандл К.В. Вакцины на основе РНК. Вакцина. 2012;30
:4414–8. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.04.060
Лундстрем К. Р. Лекарства и вакцины на основе NA. Эксперт Рев Вакцины. 2015;14
:253–63. https://doi.org/10.1586/14760584.2015.959932
Шахин У, Карико К, Туречи О. m РНК-терапия — разработка нового класса лекарств. Nat Rev Drug Discov. 2014;13
:759–80. https://doi.org/10.1038/nrd4278
Гейл А.Дж., Мандл К.В., Улмер Дж.Б. R NA: новая революция в вакцинах на основе нуклеиновых кислот. Семин Иммунол. 2013;25
:152–9. https://doi.org/10.1016/j.smim.2013.05.001
Вайсман Д. Терапия транскриптом мРНК. Эксперт Рев Вакцины. 2015;14
:265–81. https://doi.org/10.1586/14760584.2015.973859
Юн Х, Чунг Дж.К. Модифицированная мРНК как альтернатива плазмидной ДНК (пДНК) для замены транскриптов и вакцинационной терапии. Эксперт Опин Биол Тер. 2015;15
:1337–48. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.1057563
Лундстрем К. Последние разработки в области лекарств и вакцин на основе РНК. Будущая наука ОА. 2018;4
:FSO300. https://doi.org/10.4155/fsoa-2017-0151
Эберхардт В., Доллер А., Акул эль-С, Пфейлшифтер Дж. Модуляция стабильности мРНК как новый терапевтический подход. Фармакол Тер. 2007;114
:56–73. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2007.01.002
Аткинс Дж.Дж., Флитон М.Н., Шихан Б.Дж. Терапевтическое и профилактическое применение альфавирусных векторов. Эксперт преп. мол. мед. 2008;10:e33. https://doi.org/10.1017/S1462399408000859
Брито Л.А., Коммаредди С., Майоне Д., Уемацу Ю., Джовани С., Берланда Скорца Ф. и др. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины. Адв Генет. 2015;89:179–233. https://doi.org/10.1016/bs.adgen.2014.10.005
Клинман Д.М., Клащик С., Тросс Д., Широта Х., Стейнхаген Ф. Ф. Руководство DA по профилактическим ДНК-вакцинам: анализ и рекомендации. Вакцина. 2010;28
:2801–5. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.11.025
Клуг Б., Рейнхардт Дж., Робертсон Дж. Текущее состояние правил в отношении ДНК-вакцин. В: Талхамер Дж., Вайс Р., Шайблхофер С., ред. Генные вакцины. Нью-Йорк: Спрингер; 2012. С. 285–95. https://doi.org/10.1007/978-3-7091-0439-2_14
Бахл К., Сенн Дж.Дж., Южаков О., Булычев А., Брито Л.А., Хассетт К.Дж. и др. Доклиническая и клиническая демонстрация иммуногенности мРНК-вакцин против вирусов гриппа H10N8 и H7N9. Мол Тер. 2017;25
:1316–27. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.035
Ледвит Б.Дж., Манам С., Троило П.Дж., Барнум А.Б., Поли С.Дж., Гриффитс Т.Г. 2-й. Плазмидные ДНК-вакцины: анализ интеграции в геномную ДНК хозяина. Дев Биол. 2000;104:33–43.
Оглавление сертации кандидата биологических наук дисс Горяев Артем Анатольевич
СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.
ГЛАВА 1. П РОФАГ ВИРУЛЕНТНОСТИ СТХср: СТРУКТУРА ГЕНОМА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ.
1.1. Профаг вирулентности СТХф.
1.1.1. Коровая область.
1.2. Жизненный цикл профага СТХф.
2.1. Вариабельность генома профага СТХф.
2.2. Гибридные штаммы V.cholerae биовара эльтор, несущие профаг СТХф классического биовара.
ГЛАВА 2. М АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Бактериальные штаммы.
2.2. Питательные среды и культивирование штаммов.
2.3.1. Определение продукции растворимой гемагглютинин/протеазы, подвижности и способности формировать биопленку.
2.3.2. Оценка продукции холерного токсина с помощью режима пассивного иммунного гемолиза и иммуноферменого ГМ
2.3.3. Определение биологической активности холерного токсина по методу Крейга.
2.3.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов.
2.3.5. Внедрение транспозона Tn5-Mob в хромосому штаммов V.cholerae.
2.3.6. Выделение хромосомной и плазмидной ДНК.
2.3.7. Рестрикционный анализ плазмидной и хромосомной ДНК.
2.3.8. П ЦР-анализ бактериального генома соответствующих штаммов с использованием различных специфичных олигонуклеотидных праймеров.
2.3.9. Определение копийности генов ctxAB, кодирующих биосинтез холерного токсина, с помощью гибридизации ДНК-ДНК.
2.3.10. Секвенирование генов холерного оперона.
2.3.11. Протеомный анализ.
2.3.12. Определение продукции белков наружных мембран с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
2.3.13. Получение очищенного холерного токсина и характерных поликлональных антител к нему.
2.3.14. Внутрикишечное заражение крольчат-сосунков клетками изогенных штаммов с разным уровнем продукции холерного токсина.
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСПОЗОННЫХ МУТАНТОВ V. C ХОЛЕРЫ БИОВАРА ЭЛЬТОР С ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА.
3.1. Введение в клеточную модель штамма биовара V.cholerae эльтор рекомбинантной плазмиды pSUP5011 (ApR CmRKmR), основа транспозона Tn5-Mob. р с с
3.2. Получение транспозонных мутантов (Km, Ар, Cm) с измененной продукцией холерного токсина.
3.3. Фенотипический анализ инсерционных мутантов с измененной продукцией холерного токсина.
3.4. Сравнительный анализ вирулентных свойств различных мутантов с измененным уровнем биосинтеза холерного токсина.
ГЛАВА 4. М ОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСПОЗОННЫХ МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА.
4.1. Изучение активности регуляторных генов toxR и toxT, контролирующих экспрессию генов ctxAB.
4.2. Сравнительный анализ структуры генома профага СТХф у исходного штамма и его транспозонных мутантов.
4.3. Определение количества копий профага СТХф в хромосоме полученных транспозонных мутантов.
4.4. Секвенирование оперона ctxAB штаммов МАК757 и его транспозонных мутантов.
4.5. Анализ плазмидного профиля штамма KmR Тох^.
ГЛАВА 5. С РАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕОМОВ V. C HOLERAE МАК
И ЕГО ТРАНСПОЗОННОГО МУТАНТА С ГИПЕРПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО
5.1. Получение и сравнительный анализ протеомных карт изучаемых штаммов.
5.2. Выявление белков, изменивших экспрессию в результате влияния на них транспозонной мутации в геноме профага СТХср.
ГЛАВА 6. П ОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА 2 ТИПА И ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К НЕМУ.
6.1. Определение оптимальных условий культивирования сконструированного штамма гиперпродуцента холерного токсина.
6.2. Выделение и очистка холерного токсина 2-ого типа.
6.3. Получение специфической поликлональной антисыворотки к холерному токсину 2-ого типа.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Напряженная эпидемическая ситуация в мире, обусловленная продолжающимися вспышками и эпидемиями холеры в странах Юго-Восточной Азии и Африки, создают реальную возможность завоза этой инфекции на территорию России (Андрусенко и др., 2009; Ломов, 2009; Марамович и др., 2009; Safa et al, 2008; Taneja el al, 2009). К настоящему времени известно, что в результате эволюции в пределах вида образовалось три эпидемически опасных штамма, отличающихся друг от друга по структуре и функциям генома — V. cholerae 01 серогруппы классического биовара, V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор и V. cholerae 0139 серогруппы. V.cholerae классического биовара был, видимо, возбудителем первых шести пандемии (18171923 гг.) азиатской холеры. Однако к началу прошлого столетия эти вибрионы были вытеснены на эндемичной для них территории холерными вибрионами биовара эльтор, которые вызвали текущую, 7-ю, пандемию холеры, начавшуюся в 1961^ г. и продолжающуюся до сих пор (Бароян, 1971; Смирнова, Кутырев, 2004; Faruque et al., 1998; Sack et al, 2004). Что касается внезапно появившегося в-1992 г. в Индии и Бангладеш эпидемически опасного штамма V.cholerae ранее неизвестной 0139 серогруппы, то прогноз ряда исследователей о начале новой, 8-ой, пандемии холеры, связанной с этим возбудителем, пока не оправдался (Ramamurthy et al., 1993; Mukhopadhyay et al., 1995; Смирнова, 2002).
Секвенирование генома V.cholerae показало, что основные факторы его патогенности расположены на мобильных генетических элементах (МГЭ) -умеренных профагах (СТХср и RS1), «островах патогенности» (VPI-1, VPI-2) и «пандемичности» (VSP-1, VSP-2). Ключевым фактором патогенности возбудителя холер является холерный токсин (XT), биосинтез которого определяется генами ctxAB, входящими в состав, профага СТХф. При этом холерные вибрионы классического биовара продуцируют XT 1-ого типа, a V.cholerae биовара эльтор -XT 2-ого типа. Наличие большого числа МГЭ определяет высокую вариабельность генома возбудителя холеры, которая выражается в изменении его размеров и функции за счет потери или приобретения мобильных элементов. Такие изменения генома могут обусловить появление новых клонов с разным набором генов патогенности. Так, в последнее время происходит формирование патогенных клонов V. cholerae биовара эльтор, отличительной особенностью которых является присутствие либо МГЭ, либо их отдельных генов, характерных только для классических вибрионов. Наибольший интерес представляют штаммы V.cholerae биовара эльтор, содержащие классический профаг СТХф и продуцирующие XT 1-ого типа. Такие штаммы, как правило, более вирулентные, вызвали эпидемические вспышки холеры в Бангладеш, Мозамбике, Индии и Вьетнаме (Safa et al., 2006; Raychoudhuri et al, 2008; Safa et al, 2008; Nguyen et al, 2009; Taneja et al, 2009). Наряду с появлением атипичных штаммов с повышенной вирулентностью, значительную проблему представляют и нетоксигенные клоны, сохранившие весь набор других известных генов патогенности. Эти штаммы являются потенциально эпидемически опасными и способны вызывать диарейные заболевания за счет, видимо, дополнительных факторов патогенности (Онищенко и др., 2007; Монахова и др., 2009; Boyd et al., 2000; Pichel et al., 2003; Sing et al., 2001). Одним из возможных механизмов образования таких атоксигенных клонов может быть спонтанная утрата генома профага СТХф (Кулынань и др., 2006; Смирнова и др., 2007).
Таким образом, очевидна актуальность исследований, направленных на дальнейшее изучение механизмов формирования атипичных штаммов с измененными вирулентными свойствами V.cholerae. В первую очередь большой интерес представляют исследования механизмов образования высокотоксигенных штаммов V.cholerae биовара эльтор. Эта проблема имеет не только существенное фундаментальное значение, но и представляет практическую ценность, поскольку штаммы с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа могли бы использоваться для получения этого белка, необходимого для создания более эффективных -холерных диагностических и профилактических препаратов. Широкое распространение среди разных штаммов транспозонов, локализованных на плазмидах или входящих в состав интегронов, и их большой вклад в эволюцию патогенных бактерий позволяют рассмотреть возможность их участия в изменении продукции холерного токсина у возбудителя холеры эльтор.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ — получение и сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств различных атипичных по продукции холерного токсина штаммов V.cholerae биовара эльтор.
1. С помощью транспозона Tn5-Mob (KmR) на модельном штамме V.cholerae МАК757 биовара эльтор получить мутанты с измененной продукцией XT.
2. Провести сравнительный фенотипический анализ исходного штамма и мутантов с измененной продукцией XT, определив продукцию гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы (РГАП), маннозо-чувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии (МЧПА), экзополисахарида, а также подвижность и способность образовывать биопленку; дать оценку вирулентности сравниваемых штаммов.
3. Провести молекулярно-генетический анализ транспозонных мутантов с измененным уровнем продукции холерного токсина.
4. Сравнить протеомные профили исходного штамма и мутанта с гиперпродукцией XT.
5. Выделить, очистить и изучить антигенные свойства XT 2-ого типа, продуцируемого созданным штаммом V.cholerae биовара эльтор с гиперпродукцией этого белка.
Обнаружено, что внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому модельного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор, несущего две копии профага СТХср, в 5% случаев приводит к образованию различных мутантов с измененной продукцией XT. В результате молекулярно-генетического анализа впервые показано, что у мутантов I группы (KmR Тох4″‘^) произошла индуцированная транспозоном утрата одной из копий профага и сохранение в коровой области второй копии лишь генов ctxAB. Уровень биосинтеза XT у таких клонов, потерявших более 60% генома коровой части оставшегося профага, но сохранивших лишь оперон ctxAB, возрастает более чем в 2000 раз по сравнению с исходным штаммом, составляя 43,0±3,2 мкг/мл по данным ELISA. Во II группе мутантов (KmR Тох*»1″) встраивание транспозона в хромосому привело к потере одной копий профага с сохранением всех генов второй копии, что обусловило увеличение уровня биосинтеза XT более чем в 100 раз (2,7±0,7 мкг/мл). В III группу входили нетоксигенные мутанты (KmR Тох~), возникшие в результате утраты всех генов двух копий профагов за исключением гена rstR. Таким образом, показан новый, раннее не известный путь образования штаммов холерного вибриона как с повышенной токсигенностыо, так и лишенных этого свойства.
При сравнительном анализе протеомов исходного штамма (МАК757 Тох+) и его мутанта с гиперпродукцией, XT (МАК757 KmR Тох444″) обнаружено, что в клетках МАК757 KmR Тох^ из 531 выявленного белка редукция генома профага сопровождается- изменением содержания 27 белков’ из которых репрессируется синтез 23, связанных, в основном, с энергетическим обменом, и индуцируется синтез 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот. В целом, полученные данные указывают на происходящие изменения клеточного метаболизма и энергетического гомеостаза у штамма МАК757 KmR Тох»144″, что связано, видимо, с гиперэкспрессией генов XT.
Показано, что полученные мутанты как с повышенной продукцией XT, так и утративших способность синтезировать этот белок (вследствие делеции обеих копий профага СТХф) могут сохраняться в составе биопленки в течение длительного периода.
Впервые создан бесплазмидный штамм V.cholerae биовара эльтор с высоким уровнем продукции XT. Приоритетность этих данных подтверждена получением патента №2326941 «Штамм бактерий Vibrio c/zo/егае-продуцент холерного токсина II типа».
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонированы изогенные штаммы V.cholerae биовара эльтор с различной экспрессией генов ctxAB, которые могут быть использованы для получения новых данных о механизмах регуляции активности генов XT и о влиянии уровня продукции этого фактора патогенности на развитие холерогенной реакции. Полученный штамм с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа может быть использован для получения этого белка с целью изготовления более эффективных иммунодиагностических и профилактических препаратов против холеры, вызванной V.cholerae биовара эльтор.
По результатам работы составлены методические рекомендации: «Использование транспозона Tn5-Mob для получения штаммов Vibrio cholerae с измененной продукцией холерного токсина», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №1 от 09 апреля 2009 г.) и утвержденные директором (24 апреля 2009 г.).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
2. Обнаруженное повышение продукции XT у транспозонных мутантов модельного штамма V.cholerae МАК757 не связано с усилением активности глобальных регуляторных генов toxR и toxT, а обусловлено изменением генома профага СТХф, индуцированным Tn-элементом. Внедрение транспозона Tn5-Mob в бактериальный геном обусловило появление мутантов 3-х типов с редуцированным геномом профага. У мутантов I типа выявлена делеция одной копии СТХф и потеря всех генов коровой области второй копии, за искючением оперона ctxAB (KmR Tox4″**). Мутанты II типа утратили одну копию СТХф с сохранением всех генов второй копии (KmR Тох^). У мутантов III типа произошла потеря обеих копий профага СТХф, за исключением гена rstR (KmR Тох-).
3. Транспозонные мутанты с повышенным уровнем биосинтеза XT и не продуцирующие этот белок не отличаются от исходного штамма по продукции секретируемой растворимой гемагглютинин/протеазы и-‘ термолабильного гемолизина, но имеют повышенную подвижность. Штаммы с измененной продукцией XT способны формировать биопленку, что указывает на возможность их сохранения во внешней среде в течение длительного периода. Штаммы с повышенной продукцией XT были более вирулентны.
4. По данным сравнительного анализа протеомов исходного штамма V.cholerae МАК757 Тох+ и его транспозонного гипертоксигенного мутанта МАК757 KmR Тох+++ делеция генома профага СТХф у последнего сопровождалась изменением экспрессии ряда бактериальных генов. Среди 531 белков, выявленных в клетке, изменено содержание 27 белков (или 5%), связанных в основном с энергетическим обменом или участвующих в транспорте аминокислот.
5. Сконструированный штамм V.cholerae МАК757 KmR Тох»4″ биовара эльтор является стабильным и эффективным продуцентом XT 2-ого типа и может быть использован в производстве для получения этого белка. Определены оптимальные условия выращивания этого штамма: казеиновый бульон, без добавления канамицина, 30 °С, рН 7,6, время культивирования — 8 часов.
Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2008, 2009 гг.), на Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2008, 2009 гг.), на Всероссийской конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007 г.), на XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008 г.), на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008 г.), а также на III Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и эволюция» (Звенигород, 2008 г.).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав собственных исследований, заключения, выводов и- списка использованных источников, включающего 201 цитируемую работу, из них 165 зарубежных и 36 отечественных. Общий объем диссертации составляет 125 страниц. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 20 рисунками.
Заключение диссертации по теме «Микробиология», Горяев, Артем Анатольевич
1. Внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому модельного вирулентного штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор с частотою 5,5* 10~5 вызывает образование различных мутантов с измененной продукцией холерного токсина — с высоким (43 мкг/мл) и умеренным (2,7 мкг/мл) уровнем биосинтеза этого белка, а также нетоксигенных клонов.
2. В результате фенотипического анализа показано, что транспозонные мутанты с измененной продукцией холерного токсина не отличаются от исходного штамма по продукции секретируемой растворимой гемагглютинин/протеазы и термолабильного гемолизина, имеют повышенную подвижность и способны формировать биопленку, что указывает на возможность их сохранения во внешней среде в течение длительного периода.
3. Обнаружен более высокий уровень вирулентности транспозонных мутантов с повышенной продукцией холерного токсина, который выражается в 100% летальности экспериментальных животных через первые 24 часа после заражения.
4. Выявленное изменение продукции холерного токсина у транспозонных мутантов штамма V.cholerae МАК757 биовара эльтор обусловлено разной по протяженности делецией генома профага СТХф, индуцированой внедрением транспозона Tn5-Mob. Утрата только одной копии профага СТХф была характерна для KmR Тох^ клонов. Более протяженная делеция была обнаружена у KmR Тох444″ клонов и выражалась в потере одной копии профага и всех генов коровой области второй копии за исключением оперона ctxAB, что привело к его гиперэкспрессии. Самая протяженная делеция была у KmR Тох~ мутантов, которые утратили все гены профага СТХф за исключением гена rstR.
5. Впервые проведен сравнительный анализ двух протеомов исходного штамма V. cholerae МАК757 биовара эльтор и его транспозонного мутанта с гиперпродукции XT (KmR Tox^t+). Обнаружено, что из 531 выявленного белка у мутанта с повышенной продукцией XT изменено содержание 27, из которых репрессируется синтез 23 белков, в основном связанных с энергетическим обменом, и индуцируется синтез только 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот.
6. Подобраны оптимальные условия культивирования созданного штамма V.cholerae МАК757 KmR Tox^f+ биовара эльтор для получения XT. Получен и очищен холерный токсин 2-ого типа, обладающий антигенными свойствами.
На протяжении около 50 лет (с 1961 г. — по настоящее время) эпидемии холеры, вызванные V.cholerae биовара эльтор, многократно создавали сложные эпидемические ситуации во многих странах мира, включая и Российскую Федерацию. Так, по данным ВОЗ, в 2009 г. на юге Африки в Зимбабве эпидемия холеры эльтор охватила более 83000 человек, из которых 3806 умерло. Возрастающая актуальность проблемы холеры определяется еще и тем, что в современный период происходит, как указывалось выше, формирование более токсигенных природных штаммов возбудителя за счет изменения его генома. Обнаружение природных штаммов с измененной экспрессией генов холерного токсина, вызвавших эпидемии в Юго-Восточной Азии и Африке, указывает на необходимость проведения экспериментальных исследований, направленных на изучение механизма этого процесса.
В представленной работе впервые изучена роль транспозона Tn5-Mob в изменении генома профага СТХф, кодирующего XT — ключевой фактор вирулентности, и показан ранее неизвестный путь возникновения штаммов с повышенной токсигенностью. Внедрившийся транспозон явился горячей точкой для рекомбинаций, обусловивших образование делеций разной протяженности. Впервые обнаружено, что утрата одной копии профага, а также 4 генов коровой области второй копий с сохранением в ней лишь оперона ctxAB, обусловила образование штаммов с гиперпродукцией XT. Такие делеционные мутанты по данным GMi ELISA продуцируют XT больше в 2000 раз (43 мкг/мл) по сравнению с исходным штаммом (0,02 мкг/мл). Кроме того выявлены мутанты, имеющие делецию лишь одной копии профага СТХф, но сохранившие все гены второй копии. Утрата только одной копии профага также привела к повышению экспрессии сохранившихся генов ctxAB, хотя в этом случае продукция XT у делеционных мутантов повысилась примерно в 150 раз и составила 2,7 мкг/мл.
Поскольку экспрессия структурных генов ctxAB, входящих в состав профага СТХф, контролируется глобальными регуляторными генами toxR и toxT, встал вопрос об их участии в повышении экспрессии сохранившихся генов XT. Однако проведенные исследования показали, что изменение продукции XT у этой группы транспозонных мутантов не связанно с повышением активности регуляторных генов toxR и toxT. Тем не менее, несмотря на то, что механизм значительного повышения экспрессии генов ctxAB у делеционных мутантов остается! пока неизвестным, представленные данные позволяют сделать заключение, что транспозоны могут внести большой вклад в изменении активности генов основного фактора вирулентности у возбудителя холеры. На основе выявленной нами зависимости активности генов ctxAB от делеции генома профага можно предположить, что такие делеции приводят к формированию новых последовательностей в промоторной области оперона ctxAB, .кодирующего XT.
Самостоятельный интерес представляют данные об образовании нетоксигенных штаммов в результате делеции обеих копий профага СТХф. Такие штаммы, сохранившие весь известный набор других генов вирулентности и относящиеся к потенциально эпидемически опасным, нередко выделяются как от носителей, так и из разных объектов внешней среды. Между тем вопрос об их происхождении до сих пор остается малоизученным. Ранее были опубликованы данные, согласно которым нетоксигенные клоны могут формироваться из токсигенных в результате спонтанной утраты профага СТХф в результате относительно длительного пребывания возбудителя в водной среде (Кульшань и др., 2006). Нами, напротив, впервые показано, что удаление из хромосомы практически двух копий профага (за исключением гена репрессора rstR) вирулентного штамма, не находящегося в водной среде, может быть индуцировано внедрившимся в геном возбудителя транспозоном. В целом, эти сведения, наряду с данными о путях возникновения высокотоксигенных штаммов холерного вибриона, являются существенным вкладом в понимание природы изменчивости патогенности возбудителя холеры.
Одним из важных итогов работы явилось выявление уровня вирулентности полученных супертоксигенных и нетоксигенных мутантов, а также изучение их способности формировать биопленку. Супертоксигенные мутанты KmR Tox444″ оказались более вирулентными, по сравнению с исходным штаммом. Основанием для такого заключения служит тот факт, что указанные штаммы KmR Tox444″ при развитии выраженного холерогенного эффекта вызвали гибель всех зараженных животных уже в течение первых 24 часов после их заражения. В то же время все проверенные нетоксигенные (KmR Tox ) штаммы оказались авирулентными, поскольку из-за отсутствия продукции XT не могли вызвать у зараженных животных развитие холерогенной реакции. Необходимо особо отметить, что как супертоксигенные, так и нетоксигенные штаммы сохранили способность формировать биопленку, что указывает на возможность их длительного сохранения во внешней среде.
Утрата части генома, имевшая место у изучаемых мутантов, и повышение экспрессии генов ctxAB могли изменить уровень экспрессии других хромосомных генов. Для проверки данного предположения был проведен сравнительный анализ протеомов двух изогенных фенотипически разных вариантов модельного штамма V.cholerae МАК757 — исходного (Тох+) и супертоксигенного (KmR Tox444). В результате установлено, что у гипертоксигенных штаммов действительно изменено содержание 27 белков из 531 выявленных. Индуцируется синтез только 4 белков, связанных с транспортом веществ. В то же время синтез 23 белков, участвующих в основном в энергетическом обмене, был значительно снижен. Таким образом, полученные данные указывают на заметное функциональное изменение клеточного метаболизма у штамма KmR Тох44 , которое, возможно, связано с гиперпродукцией XT.
Полученные данные, о ранее неизвестных путях возникновения гипертоксигенных и нетоксигенных штаммов холерного вибриона, открывают широкие перспективы в плане получения новых фундаментальных научных знаний о молекулярно-генетических механизмах изменения патогенных и иммуногенных свойств возбудителя холеры, которые необходимы для понимания эволюции его генома, и своевременного прогнозирования возникновения штаммов с ранее неизвестными вирулентными и диагностическими свойствами.
Следует отметить также, что проведенная работа имеет важное практическое значение. Создан штамм с высоким уровнем продукции холерного токсина 2-ого типа, В-субъединица которого относится к основным протективным антигенам и определяет формирование антитоксического иммунитета при холере. Кроме того выявлены оптимальные условия (казеиновая среда, рН=7,6, 30 °С, 8 часов) малообъемного культивирования этого штамма (V.cholerae МАК757 KmR Тох444″ биовара эльтор) для максимальной продукции XT, который может быть использован для изготовления более специфических холерных диагностических и профилактических препаратов.
